科研人員獲取了PHB2蛋白的基因編碼序列（簡稱phb2基因），利用基因工程的方法使大腸桿菌表達該蛋白，以便進一步檢測PHB2蛋白抑制腫瘤細胞增殖和擴散的效果。如圖1是phb2基因編碼區(qū)序列以及兩端需添加的、能被相關(guān)酶識別的序列，圖2為研究所用表達載體示意圖，表格為有關(guān)的限制酶種類及識別序列和切割位點?；卮鹣铝袉栴}

限制酶種類	SpeⅠ	PvitⅡ	BamHⅠ	XbaⅠ
識別序列	5'A↓CT'AGT3'	5CAG↓CTG3'	S'G↓GATCC3'	5T↓CTAGA3'

（1）在利用PCR擴增phb2基因時，為了使PCR產(chǎn)物能被限制酶切割，以便構(gòu)建基因表達載體，可以考慮在引物的

5'端

5'端

（填“3'端”或“5'端“）添加限制酶識別序列。據(jù)圖可推斷，擴增α鏈時需添加的限制酶識別序列以及所用引物的堿基序列是5'

CAGCTGTCATTT

CAGCTGTCATTT

3'。已知AUG為PHB2蛋白合成的起始密碼子，則構(gòu)建符合要求的重組基因表達載體，切割圖2所用的限制酶有

PvitⅡ、XbaⅠ

PvitⅡ、XbaⅠ

。
（2）將符合要求的基因表達載體導(dǎo)入工程菌后，可用

抗原-抗體雜交

抗原-抗體雜交

技術(shù)檢測PHB2蛋白是否合成通過提取，分離和純化，從發(fā)酵液中獲得該蛋白。為防止PHB2蛋白在工程菌細胞中被降解，在發(fā)酵過程中應(yīng)選用

蛋白酶

蛋白酶

缺陷型工程菌作為受體細胞，且在發(fā)酵結(jié)束后的純化過程中應(yīng)添加蛋白酶抑制劑。
（3）腫瘤細胞通常培養(yǎng)在95%的空氣和5%的

CO₂

CO₂

（氣體）的恒溫培養(yǎng)箱中，將適量PHB2蛋白加入培養(yǎng)液后，若腫瘤細胞

增殖速率減慢（或數(shù)量減少）、細胞膜上的糖蛋白增加

增殖速率減慢（或數(shù)量減少）、細胞膜上的糖蛋白增加

，則表明該蛋白具有抑制腫瘤細胞增殖和擴散作用，據(jù)此可進一步的深入研究。