重疊延伸PCR技術(shù)是一種通過(guò)寡聚核苷酸鏈之間重疊的部分互相搭橋、互為模板，經(jīng)過(guò)多次PCR擴(kuò)增，從而獲得目的基因的方法。利用該技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)基因的定點(diǎn)誘變，其操作步驟如圖所示?；卮鹣铝袉?wèn)題：
（1）重疊延伸PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA片段時(shí)遵循的原理是

DNA半保留復(fù)制

DNA半保留復(fù)制

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（2）實(shí)現(xiàn)基因的定點(diǎn)誘變時(shí)，需要根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)兩種常規(guī)引物，以及根據(jù)突變堿基序列所處位置設(shè)計(jì)兩種突變引物，圖中屬于突變引物的是引物

b、c

b、c

；與常規(guī)引物相比，突變引物必須具備的特點(diǎn)是

兩種引物必須要有一段互補(bǔ)的序列，可以進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)

兩種引物必須要有一段互補(bǔ)的序列，可以進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)

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（3）通過(guò)PCR1能得到大量產(chǎn)物AB，該過(guò)程需要加入引物

a、b

a、b

，通過(guò)PCR2能得到大量產(chǎn)物CD，PCR1和PCR2必須分兩個(gè)系統(tǒng)進(jìn)行，不能在同一個(gè)系統(tǒng)里面，原因是

防止兩種突變引物在擴(kuò)增時(shí)進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)，失去作用

防止兩種突變引物在擴(kuò)增時(shí)進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)，失去作用

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（4）取AB上鏈和CD下鏈再次進(jìn)行擴(kuò)增（重疊延伸），即可得到突變產(chǎn)物AD，該過(guò)程一般

不需要

不需要

（填“需要”或“不需要”）加入引物，原因是

AB上鏈和CD下鏈在突變位點(diǎn)處的堿基序列互補(bǔ)，能起到引物b、c的作用

AB上鏈和CD下鏈在突變位點(diǎn)處的堿基序列互補(bǔ)，能起到引物b、c的作用

。與X射線誘變相比，該突變技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是

可以誘導(dǎo)定向變異，目的性強(qiáng)，突變概率高

可以誘導(dǎo)定向變異，目的性強(qiáng)，突變概率高

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