1965年中國科學家人工合成了具有生物活性的結(jié)晶牛胰島素，摘取了人工合成蛋白質(zhì)的桂冠。此后科學家又提出了利用基因工程改造大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素的兩種方法：“AB”法是根據(jù)胰島素A、B兩條肽鏈的氨基酸序列人工合成兩種DNA片段，利用工程菌分別合成兩條肽鏈后將其混合自然形成胰島素；“BCA”法是利用胰島B細胞中的mRNA得到胰島素基因，利用工程菌獲得胰島素。這兩種方法使用同一種質(zhì)粒作為載體。請回答下列問題。
（1）如圖1是利用基因工程生產(chǎn)人胰島素過程中使用的質(zhì)粒及目的基因的部分結(jié)構(gòu)。在設(shè)計PCR引物時最好添加限制酶

EcoRⅠ和XhoⅠ

EcoRⅠ和XhoⅠ

的識別序列，選擇依據(jù)是

胰島素基因中有SalⅠ和NheⅠ的識別序列，選用這兩種會破壞目的基因；LacZ基因和氨芐青霉素抗性基因中均有MunI的識別序列，會導(dǎo)致無法篩選；選EcoRⅠ和XhoⅠ能避免目的基因、質(zhì)粒的自身環(huán)化和反向連接，使目的基因和質(zhì)粒正確連接

胰島素基因中有SalⅠ和NheⅠ的識別序列，選用這兩種會破壞目的基因；LacZ基因和氨芐青霉素抗性基因中均有MunI的識別序列，會導(dǎo)致無法篩選；選EcoRⅠ和XhoⅠ能避免目的基因、質(zhì)粒的自身環(huán)化和反向連接，使目的基因和質(zhì)粒正確連接

。

（2）目前，科學家已通過將B鏈的第28位氨基酸—脯氨酸（密碼子為CCU）替換為天冬氨酸（密碼子為GAU），有效抑制了胰島素的聚合，研發(fā)出速效胰島素類似物產(chǎn)品。在改造用BCA法獲得的胰島素基因時，可運用大引物PCR進行定點突變，相關(guān)原理如圖2所示。
為保證有效抑制胰島素的聚合，進行第一次PCR時所用的突變上游引物的合理設(shè)計是

將CCT改為GAT

將CCT改為GAT

。利用所獲得的大引物、模板和其他引物等進行第二次PCR，要獲得帶有突變位點的、適于與上圖中質(zhì)粒構(gòu)建基因表達載體的改良基因，引物應(yīng)選用大引物兩條鏈中的

②

②

（填“①”或“②”）；至少進行

3

3

次循環(huán)才能獲得雙鏈等長的改良基因。
（3）β-半乳糖苷酶可以分解無色的X-gal產(chǎn)生藍色物質(zhì)使菌落呈現(xiàn)藍色，否則菌落為白色。將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌接種到添加了

氨芐青霉素、X-gal

氨芐青霉素、X-gal

等成分的培養(yǎng)基上，呈現(xiàn)

白

白

色的菌落即為含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌落。