轉(zhuǎn)基因重組醇母乙肝疫苗是一種乙肝表面抗原（HBsAg）亞單位疫苗。選用組氨酸脫氫酶基因（His）缺失突變體的巴斯德華赤酵母作受體細(xì)胞，它能以甲醇作為唯一碳源，但需要在添加組氨酸的培養(yǎng)基上才能存活。下圖所示質(zhì)粒中的5'AOX1、3'AOX1（TT）是強(qiáng)啟動子序列和終止子序列，請回答下列問題。

限制酶的識別序列和切割位點

限制酶	SnaBⅠ	BglⅡ	Avrli	SacⅠ
識別序列及切割位點	5'TACIGTA3'	5'AIGATCT3'	5'CICTAGG3'	5'CITCGAG3'

（1）圖示質(zhì)粒中含有的卡那霉素抗性基因kan^r、氨芐青霉素抗性基因amp^r在基因工程中一般作為

標(biāo)記基因

標(biāo)記基因

，有利于重組質(zhì)粒的篩選。質(zhì)粒中需具有多個限制酶切割位點，其作用是

以便與外源基因連接

以便與外源基因連接

。
（2）據(jù)圖和表分析，構(gòu)建重組質(zhì)粒時，HBsAg基因的B位置需接上

5'CCTAGG3'

5'CCTAGG3'

（填相應(yīng)末端的堿基序列）。經(jīng)過限制酶酶切的質(zhì)粒與HBsAg基因在進(jìn)行連接時，可選用

T₄DNA連接酶

T₄DNA連接酶

連接。
（3）圖中步驟1一般先用Ca²⁺處理大腸桿菌，使其處于

能吸收周圍環(huán)境中DNA分子

能吸收周圍環(huán)境中DNA分子

的生理狀態(tài)。由步驟2的結(jié)果分析，步驟1將重組質(zhì)粒先導(dǎo)入大腸桿菌有利于HBsAg基因在受體細(xì)胞中

增殖

增殖

。
（4）步驟3中應(yīng)選用限制酶

BglⅡ

BglⅡ

切割從大腸桿菌中分離的重組質(zhì)粒，從而獲得圖示重組DNA片段，然后將其整合到His缺失突變體酵母細(xì)胞基因組中，在不含

組氨酸

組氨酸

的培養(yǎng)基中篩選出成功導(dǎo)入了HBsAg基因的酵母細(xì)胞。
（5）與細(xì)菌相比，酵母菌更適宜作為受體細(xì)胞制備HBsAg亞單位疫苗，原因是

酵母菌為真核生物，具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等細(xì)胞器，能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)進(jìn)行加工，而細(xì)菌沒有各種細(xì)胞器（除了核糖體），不形成分泌蛋白

酵母菌為真核生物，具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等細(xì)胞器，能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)進(jìn)行加工，而細(xì)菌沒有各種細(xì)胞器（除了核糖體），不形成分泌蛋白

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