透明顫菌血紅蛋白基因vgb表達(dá)產(chǎn)物VHb蛋白能使其在低氧的環(huán)境中生長(zhǎng)良好。頂頭孢霉是好氧性真菌,其發(fā)酵產(chǎn)物頭孢菌素C有很大的市場(chǎng)需求量,但低氧環(huán)境影響其產(chǎn)量,傳統(tǒng)發(fā)酵生產(chǎn)的增氧成本高。為提高產(chǎn)量科研人員將透明顫菌血紅蛋白基因vgb基因和頂頭孢霉pcpC啟動(dòng)子進(jìn)行PCR拼接,并與質(zhì)粒1構(gòu)建重組質(zhì)粒,如圖。
注:hph是潮霉素抗性基因,Vgb基因與hph基因共用終止子。
回答下列問題:
(1)PCR過程需要設(shè)計(jì)引物,引物的作用是
使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸
使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸
。
(2)據(jù)圖所示,重疊延伸PCR拼接時(shí),若啟動(dòng)子啟動(dòng)方向與引物3延伸方向一致,引物2和引物3的5′端需分別添加 XbaⅠ、BamⅠ
XbaⅠ、BamⅠ
序列。拼接形成重組基因的目的是 使頂頭孢霉在低氧的環(huán)境中生長(zhǎng)良好,提高其發(fā)酵產(chǎn)物頭孢菌素C的產(chǎn)量
使頂頭孢霉在低氧的環(huán)境中生長(zhǎng)良好,提高其發(fā)酵產(chǎn)物頭孢菌素C的產(chǎn)量
。
(3)利用含有 潮霉素
潮霉素
的選擇培養(yǎng)基篩選菌種,最后從個(gè)體生物學(xué)水平上鑒定,若 在低氧環(huán)境下,檢測(cè)到頭孢菌素C表達(dá)量增多
在低氧環(huán)境下,檢測(cè)到頭孢菌素C表達(dá)量增多
,則表示轉(zhuǎn)化成功。
(4)為驗(yàn)證轉(zhuǎn)化成功的重組菌株遺傳穩(wěn)定性,可將菌株在 不含
不含
( 含/不含)潮霉素的液體培養(yǎng)基中連續(xù)轉(zhuǎn)接10代,取第10代菌液采用 稀釋涂布平板法
稀釋涂布平板法
法接種到 含
含
( 含/不含)潮霉素的固體培養(yǎng)基上,若能在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng),表明重組菌株遺傳穩(wěn)定性良好。