維生素C既是人與動物必需的營養(yǎng)成分，并有抗氧化作用而廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)。中國科技工作者發(fā)明的維生素C“二步發(fā)酵法”生產(chǎn)工藝是世界首創(chuàng)：第一步發(fā)酵用醋酸桿菌為菌種，第二步發(fā)酵用氧化葡萄糖酸桿菌（“小菌”）和假單胞桿菌（“大菌”）混合菌種。如圖為二步發(fā)酵法的生產(chǎn)流程，請回答有關(guān)問題：

（1）為純化和保存菌種，將一步發(fā)酵液抽樣稀釋用

涂布

涂布

法接種含有碳酸鈣粉的培養(yǎng)基上，以

C

C

（填下列選項代號）為最佳指標，分離保存菌種。
A.菌落直徑大小
B.溶鈣圈大小
C.溶鈣圈直徑與菌落直徑比值
（2）對一步發(fā)酵培養(yǎng)液檢測發(fā)現(xiàn)幾乎沒有雜菌存在，請推測可能的原因是

培養(yǎng)液呈酸性抑制雜菌的生長

培養(yǎng)液呈酸性抑制雜菌的生長

。
（3）二步發(fā)酵過程中大小菌的菌種數(shù)比例會影響產(chǎn)酸率，種液接入發(fā)酵罐前衢對種液中的大小菌計數(shù)。計數(shù)所用的培養(yǎng)基除含有與發(fā)酵液相同的成分外，還需添加

瓊脂

瓊脂

，根據(jù)菌落的

大小、顏色、形狀或隆起程度

大小、顏色、形狀或隆起程度

對培養(yǎng)波中的大小菌分別計數(shù)?，F(xiàn)某檢測員將種液稀釋接種了3個平板，統(tǒng)計假單胞桿菌的菌落數(shù)分別是30、100 和200，取平均值110。該結(jié)果可信度低，原因是

數(shù)據(jù)值間差距太大，重復(fù)性差

數(shù)據(jù)值間差距太大，重復(fù)性差

。
（4）若要嘗試固定化混合菌進行二步發(fā)酵來生產(chǎn)古龍酸，你認為固定化混合菌操作時要注意哪些方面？

大小菌的混合比例、避免包埋方法對菌種活性影響、避免包埋時混入雜菌等

大小菌的混合比例、避免包埋方法對菌種活性影響、避免包埋時混入雜菌等

（至少提出兩點）。