環(huán)狀定點(diǎn)誘變技術(shù)通過設(shè)計(jì)特定引物進(jìn)行PCR，來實(shí)現(xiàn)目標(biāo)載體的單堿基突變，從而生產(chǎn)出滿足需求的質(zhì)粒載體。質(zhì)粒 pUC18中含有限制酶 Eam1105Ⅰ（識別序列為5'-GACGGGAGTC-3'）和EcoRⅠ的識別序列。為使質(zhì)粒pUC18不能被限制酶Eam1105Ⅰ識別，但依然具有氨芐青霉素抗性，現(xiàn)對質(zhì)粒pUC18第1695個(gè)堿基（圖方框中的堿基）進(jìn)行誘變，設(shè)計(jì)了具有誘變位點(diǎn)的引物P1和不具有誘變位點(diǎn)的引物P2。具體操作流程如圖所示。
（1）為使誘變后的質(zhì)粒不能被限制酶 Eaml105Ⅰ識別，但依然具有氨芐青霉素抗性，選擇質(zhì)粒突變位點(diǎn)時(shí)應(yīng)注意 誘變的位點(diǎn)位于限制酶Eam1105Ⅰ識別序列中，誘變后編碼的氨基酸不變或不影響氨芐青霉素基因的正常表達(dá)誘變的位點(diǎn)位于限制酶Eam1105Ⅰ識別序列中，誘變后編碼的氨基酸不變或不影響氨芐青霉素基因的正常表達(dá)。
（2）進(jìn)行上述PCR反應(yīng)，緩沖液中需提供pUC18質(zhì)粒，P1、P2兩種引物以及 耐高溫DNA聚合酶、四種脫氧核苷酸耐高溫DNA聚合酶、四種脫氧核苷酸，同時(shí)通過控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行。至少經(jīng)過 22個(gè)循環(huán)，會(huì)出現(xiàn)雙鏈均被誘變的線性質(zhì)粒。擴(kuò)增得到的線性質(zhì)粒需在 T4DNA連接T4DNA連接酶的作用下才能連接成環(huán)狀質(zhì)粒。
（3）提取連接產(chǎn)物（環(huán)化后的質(zhì)粒），經(jīng)過 EcoRⅠ、Eaml105Ⅰ雙酶切，然后進(jìn)行電泳，可根據(jù)結(jié)果判斷質(zhì)粒pUC18的第1695個(gè)堿基誘變是否成功，判斷的理由是 誘變后質(zhì)粒的電泳圖譜中只有1條條帶，未誘變質(zhì)粒會(huì)出現(xiàn)2條條帶誘變后質(zhì)粒的電泳圖譜中只有1條條帶，未誘變質(zhì)粒會(huì)出現(xiàn)2條條帶。
【考點(diǎn)】基因工程的操作過程綜合；DNA片段的擴(kuò)增與電泳鑒定．
【答案】誘變的位點(diǎn)位于限制酶Eam1105Ⅰ識別序列中，誘變后編碼的氨基酸不變或不影響氨芐青霉素基因的正常表達(dá)；耐高溫DNA聚合酶、四種脫氧核苷酸；2；T4DNA連接；誘變后質(zhì)粒的電泳圖譜中只有1條條帶，未誘變質(zhì)粒會(huì)出現(xiàn)2條條帶
【解答】
【點(diǎn)評】
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發(fā)布：2024/5/30 8:0:9組卷：20引用：4難度：0.6
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發(fā)布：2024/12/20 5:0:2組卷：35引用：5難度：0.6 -
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（1）獲得轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草新品種過程中應(yīng)用的生物技術(shù)有（答出2項(xiàng)）等。
（2）為確保目的基因定向插入了質(zhì)粒，應(yīng)該選擇（填酶）切割目的基因和質(zhì)粒。在培養(yǎng)基中加入（填“氨芐青霉素”或“四環(huán)素”）對目的基因進(jìn)行篩選。
（3）培育轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草新品種的核心工作是圖中過程（填序號）。過程②③采用的方法是。
（4）⑤過程需要用到等植物激素，在誘導(dǎo)愈傷組織分化成幼苗的過程中，這兩種植物激素的比例會(huì)發(fā)生變化，原因是。發(fā)布：2024/12/20 2:30:1組卷：16引用：5難度：0.5 -
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限制酶 BamHⅠ EcoRⅠ HindⅠ NbeⅠ MunⅠ 識別序列及切割位點(diǎn) G↓CATCC G↓AATTC A↓AGCTT G↓CTAGC C↓AATTG 
發(fā)布：2024/12/20 3:30:1組卷：6引用：1難度：0.6
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