圖中甲表示含目的基因的DNA片段，圖乙表示質(zhì)粒（已知PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ三種限制酶切割后產(chǎn)生的黏性末端都不相同）。請回答下列問題：

（1）已知DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸。利用PCR技術以圖甲中的DNA片段為模板擴增目的基因，需要的引物有

B、C

B、C

（從A、B、C、D四種單鏈DNA片段中選擇）。利用PCR擴增目的基因的過程由高溫變性（0～95℃），低溫復性（55～60℃），適溫延伸（70～75℃）三個步驟構成一個循環(huán)，為使得DNA聚合酶能夠重復利用，選用的酶應在

90～95

90～95

℃處理后仍然具備催化活性。
（2）要保證目的基因能與圖乙中的質(zhì)粒準接，要將（1）中選出的兩種引物的5′端分別添加

PstⅠ

PstⅠ

和

EcoRⅠ

EcoRⅠ

兩種限制酶的識別序列。在此基礎上，對擴增的目的基因和質(zhì)粒都用這兩種限制酶處理，待基因表達載體構建完成后，加入含大腸桿菌的轉(zhuǎn)化液中。要從中分離出含該重組質(zhì)粒的大腸桿菌單菌落，請簡述操作思路：

將轉(zhuǎn)化液接種在加入四環(huán)素的固體培養(yǎng)基上，在適宜條件下培養(yǎng)一段時間后，觀察是否有菌落生長

將轉(zhuǎn)化液接種在加入四環(huán)素的固體培養(yǎng)基上，在適宜條件下培養(yǎng)一段時間后，觀察是否有菌落生長

。
（3）從DNA分子結構分析，上述操作用到的工具酶包括

限制酶

限制酶

和

DNA連接酶

DNA連接酶

，其作用的共同點是都可以作用于DNA分子的

磷酸二酯

磷酸二酯

鍵。
（4）若要將重組質(zhì)粒導入大腸桿菌，則一般先要用Ca²⁺處理大腸桿菌，目的是使大腸桿菌處于一種

吸收周圍環(huán)境中DNA分子

吸收周圍環(huán)境中DNA分子

生理狀態(tài)。