幽門(mén)螺桿菌是一種常見(jiàn)的人類(lèi)致病菌，其骨架蛋白MreB通過(guò)影響脲酶活性而參與調(diào)控其致病性。為了更準(zhǔn)確地分離出MreB蛋白，用重疊延伸PCR技術(shù)（指在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，采用具有互補(bǔ)末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成重疊鏈，通過(guò)重疊鏈的延伸，將不同來(lái)源的片段重疊拼接起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)），將幽門(mén)螺桿菌MreB基因中編碼終止密碼子前的DNA序列與TAP標(biāo)簽（可以標(biāo)記幽門(mén)螺桿菌基因組中任何一個(gè)基因，且不會(huì)影響基因的表達(dá)）進(jìn)行連接，構(gòu)建了融合表達(dá)蛋白MreB和TAP標(biāo)簽的質(zhì)粒，實(shí)驗(yàn)流程如圖所示。據(jù)圖回答下列問(wèn)題：

（1）重疊PCR獲得帶有標(biāo)簽的MreB基因。
①獲得兩種具有重疊片段DNA的過(guò)程中，PCR1和PCR2必須在不同的反應(yīng)體系中，原因是

引物2和引物3中存在互補(bǔ)配對(duì)的片段，置于同一反應(yīng)體系時(shí)，它們會(huì)發(fā)生結(jié)合而失去作用

引物2和引物3中存在互補(bǔ)配對(duì)的片段，置于同一反應(yīng)體系時(shí)，它們會(huì)發(fā)生結(jié)合而失去作用

。
②PCR3反應(yīng)體系中所加入的引物是

引物1、引物4

引物1、引物4

。
（2）重組質(zhì)粒的構(gòu)建。
①為將帶有標(biāo)簽的MreB基因定向插入到pK18mobsacB質(zhì)粒中，需要在引物末端添加限制酶識(shí)別序列，據(jù)圖分析，在引物1添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是

SmaI

SmaI

，在引物4添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是

XhoI

XhoI

。經(jīng)過(guò)這兩種酶酶切的帶有標(biāo)簽的MreB基因和pK18mobsacB質(zhì)粒進(jìn)行連接時(shí)，可選用

T4DNA連接酶

T4DNA連接酶

（填“E.coliDNA連接酶”或“T4DNA連接酶”）。
②重組質(zhì)粒中，KmR基因的作用是

為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)

為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)

。