已知組成型啟動(dòng)子可以高效地啟動(dòng)目的基因在植物各種組織中的表達(dá)，但常會(huì)阻礙植物的生長發(fā)育。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可在特定環(huán)境條件下誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)。沙冬青脫水素基因（AmDHN基因）能使植株具有較強(qiáng)的抗旱作用?？蒲腥藛T通過構(gòu)建AmDHN基因表達(dá)載體，以培育耐旱苜蓿新品種，所用載體如圖1所示，請回答下列問題：
| 限制酶 |
Be1Ⅰ |
SacⅠ |
BamHⅠ |
PstⅠ |
SmaⅠ |
| 識(shí)別序列和酶切位點(diǎn) |
T↓GATCA |
GAGCT↓C |
G↓GATCC |
CTGCA↓G |
CCC↓GGG |
（1）用載體1構(gòu)建含AmDHN目的基因的表達(dá)載體，可以成功轉(zhuǎn)化苜蓿，但會(huì)出現(xiàn)抑制抗性芽生長和抗性植株生根的現(xiàn)象，推測
35S啟動(dòng)子屬于
組成型
組成型
啟動(dòng)子。
（2）如表是科研人員擴(kuò)增Rd29A啟動(dòng)子所設(shè)計(jì)的引物，根據(jù)引物的堿基序列及限制酶的識(shí)別序列分析，構(gòu)建載體2時(shí)選用的限制酶是
SacⅠ和SmaⅠ
SacⅠ和SmaⅠ
。為了改造載體1中的啟動(dòng)子，需要用
BclⅠ和SacⅠ
BclⅠ和SacⅠ
酶切割載體1、2為最佳。
上游引物P1：5'-GACCCGGGTTTCCAAAGATTTTTTTC-3'
下游引物P2：5'-GAGAGCTCTGGGGTTTTGCTTTTGAATGT-3' |
（3）構(gòu)建Rd29A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)AmDHN基因的表達(dá)載體后，先將其導(dǎo)入
農(nóng)桿菌
農(nóng)桿菌
，再轉(zhuǎn)化苜蓿。轉(zhuǎn)化后應(yīng)在培養(yǎng)基中添加
新霉素
新霉素
進(jìn)行篩選。
（4）為檢測轉(zhuǎn)基因苜蓿中AmDHN基因的表達(dá)水平，科研人員做了相關(guān)實(shí)驗(yàn)。如表呈現(xiàn)了部分操作步驟，請完成表格：
| 實(shí)驗(yàn)步驟的目的 |
簡要操作過程 |
| ① 使幼苗適應(yīng)外界的自然環(huán)境（進(jìn)行煉苗）材料處理 使幼苗適應(yīng)外界的自然環(huán)境（進(jìn)行煉苗）材料處理 |
在轉(zhuǎn)基因無菌苗根系長至 2～3 cm 時(shí)，將培養(yǎng)無菌苗三角瓶的封口膜打開，培養(yǎng)一周，觀察其生長狀況 |
| 提供適宜生長條件 |
將甲組幼苗根系置于300mL水中 |
| 模擬干旱脅迫條件 |
② 將乙組幼苗根系置于等量的20%PEG溶液中 將乙組幼苗根系置于等量的20%PEG溶液中 |
| 無關(guān)變量控制 |
將甲、乙兩組置于溫度、光照等條件適宜且相同的環(huán)境中培養(yǎng)8h,之后剪取兩組葉片放在液氮中儲(chǔ)存 |
| ③ 檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量，估算目的基因的表達(dá)量 檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量，估算目的基因的表達(dá)量 |
對葉片研磨、離心后，提取④ （總）RNA （總）RNA ，以AmDHN和MtActin基因⑤兩端脫氧核苷酸序列 兩端脫氧核苷酸序列 為依據(jù)設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，其中MtActin（一種細(xì)胞骨架蛋白）為內(nèi)參。擴(kuò)增產(chǎn)物用⑥瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖凝膠電泳 檢測，EB（溴化乙錠）染色照相如圖。
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