在轉(zhuǎn)基因植株培育過程中,通常在利用除草劑抗性基因作為標(biāo)記基因?qū)D(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行篩選后,再將該類標(biāo)記基因刪除是提高轉(zhuǎn)基因植物生物安全性的重要措施之一。啤酒酵母中的FLP重組酶可以定點(diǎn)刪除位于兩個(gè)frt(短特異性靶DNA序列)之間的基因。研究人員將含frt位點(diǎn)的重組T質(zhì)粒A和含F(xiàn)LP重組酶基因的重組Ti質(zhì)粒B先后轉(zhuǎn)入煙草植株,再通過熱誘導(dǎo)處理,最終成功培育出了無綠黃?。ㄒ环N除草劑)基因(als)的轉(zhuǎn)基因耐鹽煙草植株。
回答下列問題:
(1)Ti質(zhì)粒中的T-DNA的作用是
(T-DNA)可整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上
(T-DNA)可整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上
。
(2)在構(gòu)建重組T質(zhì)粒A時(shí),先選擇圖1中的引物 2、3
2、3
對als基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,再用 NcoⅠ、PstⅠ
NcoⅠ、PstⅠ
酶同時(shí)切割als基因和Ti質(zhì)粒A(圖2),并利用 DNA連接
DNA連接
酶連接形成重組Ti質(zhì)粒A。
(3)提取啤酒酵母的RNA,通過 逆轉(zhuǎn)錄
逆轉(zhuǎn)錄
獲得 cDNA
cDNA
,再利用PCR擴(kuò)增出FLP重組酶基因。為便于構(gòu)建出重組Ti質(zhì)粒B(圖3),可在FLP重組酶基因PCR引物的 5’端
5’端
(5'端/3'端)加上BamHI和KpnⅠ酶的識別序列。
(4)通常采用 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
法先后將重組Ti質(zhì)粒A和B轉(zhuǎn)入煙草細(xì)胞中,并在含 潮霉素、綠黃隆
潮霉素、綠黃隆
的培養(yǎng)基中培養(yǎng),篩選出含重組Ti質(zhì)粒A和B的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
(5)相比于普通啟動(dòng)子,本實(shí)驗(yàn)選擇hsp啟動(dòng)子的優(yōu)勢是 可在篩選出轉(zhuǎn)基因植株后,再通過熱誘導(dǎo)將als基因切除
可在篩選出轉(zhuǎn)基因植株后,再通過熱誘導(dǎo)將als基因切除
。
(6)als基因長度約1.7kb,經(jīng)熱誘導(dǎo)被FLP重組酶成功切除后,其長度變?yōu)?.4kb。提取若干經(jīng)熱誘導(dǎo)處理的轉(zhuǎn)基因煙草植株的DNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,其電泳檢測結(jié)果如圖4所示。圖中 1、3
1、3
(填數(shù)字)所對應(yīng)植株為成功切除als基因的轉(zhuǎn)基因煙草植株。