為培育轉(zhuǎn)固氮基因的小麥新品種，科研人員利用土壤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒和普通質(zhì)粒按下圖構(gòu)建了雙元載體系統(tǒng)（Ti輔助質(zhì)粒和T—DNA給體質(zhì)粒），圖中vir基因編碼產(chǎn)物能激活T—DNA轉(zhuǎn)移，ori為復(fù)制原點，tmr和tms為致瘤基因，LB和RB為T—DNA兩端的重復(fù)序列，kan^r為卡那霉素抗性基因，tet^r為四環(huán)素抗性基因。下表是幾種限制酶識別序列及切割位點?；卮鹣铝袉栴}：

限制酶	EcoRI	BamHI	BclI	SmaI	Xmal
識別序列及切割位點	G↓AATTC	G↓GATTC	T↓GATCA	CCC↓GGG	C↓CCGGC

（1）T—DNA轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞可使植物患“腫瘤”，其原因是

T—DNA中含有致瘤基因tmr、Ims

T—DNA中含有致瘤基因tmr、Ims

為防止植物形成“腫瘤”，研究人員按上圖構(gòu)建了雙元載體系統(tǒng)。圖中過程①需先用

SmaⅠ和BamHⅠ

SmaⅠ和BamHⅠ

限制酶處理Ti質(zhì)粒，再用

T₄DNA 連接酶

T₄DNA 連接酶

（填“E?coliDNA連接酶”或“T₄DNA連接酶”）將經(jīng)過處理的固氮基因接入Ti質(zhì)粒，以構(gòu)建重組質(zhì)粒。圖中過程④可以實現(xiàn)的原因是

A片段兩端的粘性末端相同

A片段兩端的粘性末端相同

。
（2）將上述構(gòu)建的雙元載體系統(tǒng)導(dǎo)入土壤農(nóng)桿菌時，往往需要在培養(yǎng)液中添加

Ca²⁺

Ca²⁺

。選擇在含有

卡那霉素

卡那霉素

的培養(yǎng)基上能形成菌落的土壤農(nóng)桿菌去感染小麥細(xì)胞，可以獲得染色體DNA上插入了固氨基因的小麥細(xì)胞，其原因是

能在含卡那霉素培養(yǎng)基上生長的土壤農(nóng)桿菌中，可能含有雙元載體系統(tǒng)：其中Ti輔助質(zhì)粒上的vir基因編碼的產(chǎn)物能促進給體質(zhì)粒中T—DNA的轉(zhuǎn)移，使T—DNA上的固氮基因插入到小麥細(xì)胞的染色體DNA上

能在含卡那霉素培養(yǎng)基上生長的土壤農(nóng)桿菌中，可能含有雙元載體系統(tǒng)：其中Ti輔助質(zhì)粒上的vir基因編碼的產(chǎn)物能促進給體質(zhì)粒中T—DNA的轉(zhuǎn)移，使T—DNA上的固氮基因插入到小麥細(xì)胞的染色體DNA上

。