科學(xué)家卡彭蒂娜和杜德娜發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌中存在清除入侵病毒 DNA 的功能系統(tǒng)，并發(fā)明了 CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)，因此獲得 2020 年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。該系統(tǒng)主要包含向?qū)?nbsp;RNA（sgRNA）和Cas9 蛋白兩部分，sgRNA 能特異性識(shí)別結(jié)合特定的 DNA 序列，從而引導(dǎo) Cas9 蛋白到相應(yīng)位置剪切 DNA，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因序列定點(diǎn)編輯，其工作原理如圖 1所示?？蒲腥藛T通過誘變得到喪失剪接功能的 dCas9，并建構(gòu) CRISPR/dCas9 系統(tǒng)，保留了sgRNA引導(dǎo)進(jìn)入基因組的能力；dCas9 與 VP64、P65 等轉(zhuǎn)錄激活因子融合，形成的 dCas9-SAM 可用于基因調(diào)控等研究。

（1）CRISPR/Cas9系統(tǒng)能精準(zhǔn)識(shí)別相關(guān)基因，依據(jù)的原理是 sgRNA與目標(biāo)DNA 發(fā)生

堿基互補(bǔ)配對(duì)

堿基互補(bǔ)配對(duì)

；Cas9 蛋白可催化

磷酸二酯鍵

磷酸二酯鍵

（填化學(xué)鍵名稱）水解，剪切特定 DNA 片段。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)廣泛存在于細(xì)菌等原核生物中的生理意義是

防止外源基因插入和表達(dá)，保證原核生物自身安全和遺傳穩(wěn)定

防止外源基因插入和表達(dá)，保證原核生物自身安全和遺傳穩(wěn)定

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（2）將 OCT4、KLF4、MYC及SOX₂ 四個(gè)基因的 sgRNA 序列串聯(lián)成的sgRNA質(zhì)粒和 dCas9-SAM質(zhì)粒與磷脂等混合，形成包埋 DNA 脂質(zhì)體，將脂質(zhì)體加入細(xì)胞系 MCF7的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，即可將外源 DNA 導(dǎo)入細(xì)胞中。24h后通過添加

抗生素G418和嘌呤霉素

抗生素G418和嘌呤霉素

篩選并進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)即可得到基因編輯后的細(xì)胞。此過程須在37℃，氣體環(huán)境為

95%空氣加5%CO₂的混合氣體

95%空氣加5%CO₂的混合氣體

的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行。該實(shí)驗(yàn)通過4種 sgRNA 對(duì) MCF7 細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，可實(shí)現(xiàn)多基因

同時(shí)調(diào)控（或表達(dá)）

同時(shí)調(diào)控（或表達(dá)）

的目的。
（3）實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CRISRP/Cas9 基因編輯技術(shù)有時(shí)存在編輯對(duì)象出錯(cuò)而造成“脫靶“，sgRNA 的序列長(zhǎng)短影響成功率，序列越短，脫靶率越高。分析脫靶最可能的原因：

非基因編輯對(duì)象也可能含有與sgRNA配對(duì)的堿基序列，造成sgRNA選錯(cuò)對(duì)象與之錯(cuò)誤結(jié)合而脫靶

非基因編輯對(duì)象也可能含有與sgRNA配對(duì)的堿基序列，造成sgRNA選錯(cuò)對(duì)象與之錯(cuò)誤結(jié)合而脫靶

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（4）為了獲得某水稻品種的不育系，研究人員利用 Cas9 蛋白對(duì)該品種的 TMS5 基因進(jìn)行編輯。首先從水稻組織中提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得總 cDNA，然后通過PCR技術(shù)可準(zhǔn)確擴(kuò)增出 TMS5 基因，原因是

加入的特定引物能與總cDNA中TMSS基因特異性結(jié)合

加入的特定引物能與總cDNA中TMSS基因特異性結(jié)合

。在篩選出成功導(dǎo)入 TMS5 基因表達(dá)載體的水稻愈傷組織后，經(jīng)多代培養(yǎng)仍能提取出TMS5 基因，你認(rèn)為 TMS5 基因是否已成功轉(zhuǎn)化？說明你的觀點(diǎn)及理由：

不一定，轉(zhuǎn)化是指目的基因成功導(dǎo)入受體細(xì)胞并穩(wěn)定存在和表達(dá)，僅提取到TMS5基因不能說明它能否正常表達(dá)

不一定，轉(zhuǎn)化是指目的基因成功導(dǎo)入受體細(xì)胞并穩(wěn)定存在和表達(dá)，僅提取到TMS5基因不能說明它能否正常表達(dá)

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