金屬硫蛋白（MT）是一類廣泛存在于動植物中具有金屬結(jié)合能力的蛋白質(zhì)，決定該蛋白質(zhì)合成的基因結(jié)構(gòu)如圖1所示，其中A鏈為編碼鏈、B鏈為模板鏈。科研人員利用圖2所示質(zhì)粒構(gòu)建棗樹的MT基因重組DNA分子并導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞，獲得對重金屬鎘（Cd）具有吸附能力和耐受能力的MT工程菌?；卮鹣铝袉栴}：

（注：XhoⅠ、KpnⅠ、PstⅠ為不同限制酶的識別位點：LacZ基因編碼產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶可以催化無色物質(zhì)X-gal產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，否則菌落為白色：amp基因為氨芐青霉素抗性基因。）
（1）獲取目的基因提取棗樹細(xì)胞的

mRNA

mRNA

，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA：為了使PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物按照正確的方向與已被酶切的載體連接，克隆MT基因時應(yīng)選擇的引物組合是

引物Ⅱ和引物Ⅲ

引物Ⅱ和引物Ⅲ

，并在其

5'

5'

（填“5′或3′”）末端分別添加限制酶

KpnI和XhoI

KpnI和XhoI

的識別序列。
（2）構(gòu)建重組DNA分子啟動子是

RNA聚合酶

RNA聚合酶

識別并結(jié)合的部位：基因工程中構(gòu)建用于原核生物的表達(dá)載體時，常用的啟動子不包括以下哪一項？

D

D

。（A、噬菌體基因啟動子B、乳酸菌基因啟動子C、大腸桿菌基因啟動子D、棗樹MT基因啟動子）
（3）導(dǎo)入、篩選和鑒定MT工程菌。
①將得到的混合物導(dǎo)入到用

Ca²⁺

Ca²⁺

處理的大腸桿菌完成

轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)化

實驗。
②將菌液稀釋并涂布在含X-gal和氨芐青霉素的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)后，隨機挑取

白色

白色

的單菌落可獲得MT工程菌。
③欲進(jìn)一步對MT工程菌進(jìn)行鑒定，可將挑取出的MT工程菌與

普通大腸桿菌

普通大腸桿菌

分別接種至含

（一定濃度的重金屬）鎘

（一定濃度的重金屬）鎘

的LB液體培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，適宜時間后檢測菌種數(shù)量。
（4）擴(kuò)大菌種將MT工程菌接種至發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增，培養(yǎng)過程中可定期取樣并使用細(xì)菌計數(shù)板對

菌體

菌體

（填“菌體”或“菌落”）進(jìn)行直接計數(shù)，以評估增殖情況。發(fā)酵結(jié)束后，采用

過濾、沉淀

過濾、沉淀

等方法獲得所需的發(fā)酵產(chǎn)品。