糖化酶是將淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖的酶。大部分野生酵母菌因缺乏糖化酶基因而不能直接利用淀粉。研究人員將經(jīng)誘變處理獲取的黑曲霉菌高產(chǎn)糖化酶基因?qū)氘叧嘟湍窯S115中，構(gòu)建能直接利用淀粉的工程菌，該過程所用質(zhì)粒（僅示部分結(jié)構(gòu)）如圖1所示。請回答下列問題。

（1）為獲得糖化酶高產(chǎn)菌株，研究人員將經(jīng)誘變處理后的黑曲霉菌接種到淀粉含量

高

高

（填“高”或“低”）的培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)適宜時間后滴加碘液，挑選出透明圈直徑

較大

較大

（填“較大”或“較小”）的菌株，再進(jìn)行復(fù)篩以及穩(wěn)定性遺傳實驗。
（2）為獲取和擴(kuò)增高產(chǎn)糖化酶基因，研究人員提取出糖化酶高產(chǎn)菌株的基因組，并根據(jù)高產(chǎn)糖化酶基因的部分核苷酸序列設(shè)計

特異性引物

特異性引物

進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR每次循環(huán)都包括變性、

復(fù)性

復(fù)性

和延伸三步，在循環(huán)前常要進(jìn)行一次94℃、5min預(yù)變性，其目的是

增加模板DNA徹底變性的概率

增加模板DNA徹底變性的概率

。
（3）構(gòu)建高產(chǎn)糖化酶基因表達(dá)載體時，用限制酶EcoRⅠ和NotⅠ切割質(zhì)粒pPIC9K，37℃，15min后需將溫度升高至65℃并保溫20min,目的是使

限制酶失活

限制酶失活

，從而終止酶切反應(yīng)。圖2是高產(chǎn)糖化酶基因示意圖（僅示部分堿基），為使其能正確插入表達(dá)載體并成功表達(dá)，則圖中A處的堿基序列應(yīng)為

5′-GCGGCCGC-3′

5′-GCGGCCGC-3′

。
（4）畢赤酵母GS115是一種組氨酸營養(yǎng)缺陷型微生物，自身不能合成生長必需的組氨酸，并且對氨芐青霉素和卡那霉素均不敏感，因此可利用

不含組氨酸

不含組氨酸

的基礎(chǔ)培養(yǎng)基篩選導(dǎo)入高產(chǎn)糖化酶基因表達(dá)載體的畢赤酵母GS115（重組細(xì)胞），再將重組細(xì)胞轉(zhuǎn)接至以甲醇為唯一碳源的培養(yǎng)液中進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶性能測定。上述過程中，甲醇除作為碳源、提供能量外，還具有

誘導(dǎo)P_AOX1啟動，使高產(chǎn)糖化酶基因大量表達(dá)

誘導(dǎo)P_AOX1啟動，使高產(chǎn)糖化酶基因大量表達(dá)

的作用。
（5）為進(jìn)一步揭示黑曲霉菌高產(chǎn)糖化酶基因突變的分子機(jī)制，研究人員將高產(chǎn)糖化酶基因上游表達(dá)調(diào)控序列與野生糖化酶基因同一區(qū)段的序列進(jìn)行對比分析，具體差異如圖3，據(jù)此推測，糖化酶基因突變可能是該序列發(fā)生了堿基（對）的

缺失和替換

缺失和替換

所致。