某實驗室需構(gòu)建含增強型綠色熒光蛋白(eGFP)基因的表達載體用于科學研究。相關(guān)資料如下:
①雙鏈DNA的每一條鏈有兩個末端,分別是5′端和3′端,從左到右的5′-3′DNA鏈是編碼鏈,從左到右的3′-5′DNA鏈是模板鏈。
②增強型綠色熒光蛋白(eGFP)在自然光下顯示綠色,已知該基因的DNA編碼序列如下:5′ATGGTGAGC……AAGTAA3′。
③質(zhì)粒載體中含有EcoRⅠ、HindⅢ、BamHI、XbaⅠ和NotⅠ等酶的酶切位點(這些酶各自的識別序列不同),如圖所示。
回答下列問題:
(1)增強型綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)錄的mRNA堿基序列為5’AUGGUGAGC……AAGUAA3’5’AUGGUGAGC……AAGUAA3’。
(2)通過PCR方法獲得eGFP目的片段,首先需要設(shè)計一對一對(填“一對”或“一個”)引物,在體外選擇性擴增eGFP目的片段,PCR反應(yīng)一般由95℃熱變性、55~60℃引物和模板配對、72℃延伸三個步驟,經(jīng)過多次循環(huán)完成。延伸階段選用72℃是綜合考慮了兩個因素,這兩個因素是防止DNA變性防止DNA變性和保存Taq酶所需溫度條件保存Taq酶所需溫度條件。
(3)eGFP的PCR產(chǎn)物兩端分別含有BamHⅠ和NotⅠ的酶切位點,構(gòu)建重組表達載體時,用這兩種酶酶切PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒載體。與單一酶酶切相比,該實驗采用的雙酶切方法的優(yōu)點是防止目的基因與質(zhì)粒任意連接防止目的基因與質(zhì)粒任意連接(答一點即可)。
(4)將所構(gòu)建的表達載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌,涂布含有卡那霉素的平板,若表達載體構(gòu)建成功,可觀察到多個綠色熒光綠色熒光單菌落。
【考點】基因工程的操作過程綜合.
【答案】5’AUGGUGAGC……AAGUAA3’;一對;防止DNA變性;保存Taq酶所需溫度條件;防止目的基因與質(zhì)粒任意連接;綠色熒光
【解答】
【點評】
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