如圖是將乙肝病毒表面主蛋白基因HBsAg導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母菌生產(chǎn)乙肝疫苗的過程圖。巴斯德畢赤酵母菌是一種甲基營養(yǎng)型酵母，能將甲醇作為其唯一碳源。該酵母菌體內(nèi)無天然質(zhì)粒，科學(xué)家改造出了圖1所示的pPIC9K質(zhì)粒用作載體，其與目的基因形成的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切后可以與酵母菌染色體發(fā)生同源重組，將目的基因整合于染色體中以實現(xiàn)表達(dá)。已知當(dāng)甲醇作為唯一碳源時，該酵母菌中AOX1基因受到誘導(dǎo)而表達(dá)（5'AOX1和3'AOX1（TT）分別是基因AOX1的啟動子和終止子）。請分析回答：

（1）為實現(xiàn)HBsAg基因和pPIC9K質(zhì)粒重組，應(yīng)該選擇

SnaBI　AvrⅡ

SnaBI　AvrⅡ

切割質(zhì)粒，并在HBsAg基因兩側(cè)的A和B位置接上

相應(yīng)的限制酶識別序列

相應(yīng)的限制酶識別序列

，這樣設(shè)計的優(yōu)點是

確保定向連接（避免質(zhì)粒和目的基因自身環(huán)化及自連）

確保定向連接（避免質(zhì)粒和目的基因自身環(huán)化及自連）

。
（2）酶切獲取HBsAg基因后，需用

DNA連接酶

DNA連接酶

將其連接到pPIC9K質(zhì)粒上，形成重組質(zhì)粒，并將其導(dǎo)入大腸桿菌以獲取

大量重組質(zhì)粒

大量重組質(zhì)粒

。
（3）步驟3中應(yīng)選用限制酶

BglⅡ

BglⅡ

來切割重組質(zhì)粒以獲得重組DNA，然后再將其導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母菌細(xì)胞。
（4）為了確認(rèn)巴斯德畢赤酵母菌轉(zhuǎn)化是否成功，在培養(yǎng)基中應(yīng)該加入

卡拉霉素

卡拉霉素

以便篩選：若要檢測轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞中是否含有HBsAg基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，可以用

分子雜交

分子雜交

方法進行檢測。
（5）轉(zhuǎn)化的酵母菌在培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時間后，需要向其中加入

甲醇

甲醇

以維持其生活，同時誘導(dǎo)HBsAg基因表達(dá)。