T-2毒素是一種由霉菌分泌的脂溶性小分子，可通過(guò)污染飼料引起畜禽中毒反應(yīng)。CYP3A是豬體內(nèi)降解T-2毒素的關(guān)鍵酶，T-2毒素可誘導(dǎo)CYP3A基因表達(dá)水平升高。

（1）T-2毒素是霉菌的

次級(jí)

次級(jí)

（選填“初級(jí)”或“次級(jí)”）代謝產(chǎn)物，主要以

自由擴(kuò)散

自由擴(kuò)散

方式進(jìn)入豬細(xì)胞。
（2）B1和B2是CYP3A基因啟動(dòng)子上游的兩個(gè)調(diào)控序列，為研究T-2毒素誘導(dǎo)CYP3A基因表達(dá)的機(jī)理，研究者首先將不同調(diào)控序列分別和CYP3A基因啟動(dòng)子及熒光素酶基因（LUC基因）連接構(gòu)建表達(dá)載體，再分別導(dǎo)入豬肝細(xì)胞，然后向各組豬肝細(xì)胞培養(yǎng)液中加入

等量的T-2毒素

等量的T-2毒素

，適宜條件下進(jìn)行培養(yǎng)；24h后檢測(cè)LUC酶活性，計(jì)算啟動(dòng)子活性相對(duì)值，結(jié)果如圖1所示。據(jù)圖可知，B1和B2調(diào)控序列是CYP3A基因響應(yīng)T-2毒素的核心元件，理由是

缺失兩個(gè)調(diào)控序列或其中任一個(gè)，T-2毒素都不能誘導(dǎo)啟動(dòng)子活性增強(qiáng)

缺失兩個(gè)調(diào)控序列或其中任一個(gè)，T-2毒素都不能誘導(dǎo)啟動(dòng)子活性增強(qiáng)

。
（3）研究表明NF-Y和Sp1兩種蛋白均參與T-2毒素對(duì)CYP3A的誘導(dǎo)，B2是Sp1的結(jié)合位點(diǎn)。研究者推測(cè)，NF-Y通過(guò)與B1結(jié)合，與Sp1共同調(diào)控CYP3A基因的表達(dá)。
①為證明B1是NF-Y的結(jié)合位點(diǎn)，研究者依據(jù)B1序列制備了野生型和突變型探針，分別與豬肝細(xì)胞核蛋白提取物混合，實(shí)驗(yàn)分組及結(jié)果如圖2．據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，第4組出現(xiàn)阻滯帶的原因是

結(jié)合位點(diǎn)突變的探針不能結(jié)合核蛋白中的NF-Y，也不會(huì)競(jìng)爭(zhēng)NF-Y與標(biāo)記探針的結(jié)合，所以第4組與第2組同樣位置出現(xiàn)阻滯帶

結(jié)合位點(diǎn)突變的探針不能結(jié)合核蛋白中的NF-Y，也不會(huì)競(jìng)爭(zhēng)NF-Y與標(biāo)記探針的結(jié)合，所以第4組與第2組同樣位置出現(xiàn)阻滯帶

，進(jìn)而推測(cè)第5組結(jié)果產(chǎn)生的原因是

NF-Y的抗體結(jié)合NF-Y，因此第5組中出現(xiàn)標(biāo)記探針、NF-Y和NF-Y抗體的結(jié)合物，結(jié)合物分子量大，阻滯帶的位置更靠后

NF-Y的抗體結(jié)合NF-Y，因此第5組中出現(xiàn)標(biāo)記探針、NF-Y和NF-Y抗體的結(jié)合物，結(jié)合物分子量大，阻滯帶的位置更靠后

。
②研究者設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了NF-Y和Sp1通過(guò)互作共同發(fā)揮調(diào)控功能，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路是：增大或縮小B1和B2兩者之間的距離，檢測(cè)CYP3A基因的啟動(dòng)子活性。據(jù)此分析，實(shí)驗(yàn)假設(shè)是

NF-Y和Sp1通過(guò)互作共同發(fā)揮調(diào)控功能，它們之間的距離是發(fā)揮作用的最佳距離

NF-Y和Sp1通過(guò)互作共同發(fā)揮調(diào)控功能，它們之間的距離是發(fā)揮作用的最佳距離

。