糖尿病是全球患病率最高的慢性病之一，胰島素是最主要的治療藥物，需求量非常大。研究者利用圖中質(zhì)粒構(gòu)建重組DNA分子并導(dǎo)入大腸桿菌，獲得生產(chǎn)胰島素的工程菌

注：EcoRⅠ、BamHⅠ、SmaⅠ為不同的限制酶，LacZ基因能編碼產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，可催化無色物質(zhì)X-gal 產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)使菌落呈藍(lán)色，否則為白色，以顏色不同為依據(jù)直接篩選含重組DNA分子菌體的方法稱為“藍(lán)白斑”法。
回答下列問題：
（1）獲取目的基因。提取胰島β細(xì)胞中的總RNA，通過一定方法分離純化出mRNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到

cDNA

cDNA

然后設(shè)計(jì)引物利用PCR擴(kuò)增胰島素基因。選擇胰島β細(xì)胞提取RNA的原因是

胰島β細(xì)胞選擇性表達(dá)胰島素基因

胰島β細(xì)胞選擇性表達(dá)胰島素基因

。
（2）構(gòu)建重組DNA分子。為使所得的胰島素基因能按照正確的方向與載體連接，利用PCR 擴(kuò)增目的基因時(shí)，在目的基因的左右端分別添加

SmaⅠ、BamHⅠ

SmaⅠ、BamHⅠ

限制酶的識別序列，且識別序列應(yīng)添加在引物的

5'

5'

（填“3′”或“5′”）端。
（3）導(dǎo)入、篩選和鑒定。
①將大腸桿菌放在低溫、低濃度的CaCl₂溶液中，使

細(xì)胞膜

細(xì)胞膜

的通透性改變，成為感受態(tài)細(xì)胞，提高轉(zhuǎn)化效率。
②“藍(lán)白斑”法是基因工程中常用的篩選方法。為了達(dá)到篩選目的，根據(jù)所用載體質(zhì)粒的遺傳特性，受體大腸桿菌需具備

氨芐青霉素

氨芐青霉素

敏感和

β-半乳糖苷酶

β-半乳糖苷酶

缺陷等特征。篩選時(shí)，將轉(zhuǎn)化后的菌液經(jīng)稀釋后用涂布分離法接種于含

氨芐青霉素和X-gal

氨芐青霉素和X-gal

的培養(yǎng)基，經(jīng)培養(yǎng)后挑取白色的單菌落，即為目標(biāo)工程菌。
③為更加精準(zhǔn)地鑒定受體細(xì)胞中是否轉(zhuǎn)入目的基因，可采用

核酸分子雜交

核酸分子雜交

和PCR等方法，PCR 后可用凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。下列屬于影響DNA遷移速率因素的是

ABCD

ABCD

（A．DNA 分子大小 B．DNA分子形狀 C．所帶電荷情況 D．凝膠濃度）
（4）驗(yàn)證胰島素功能。為驗(yàn)證胰島素的降血糖功能，某生物小組以小鼠的活動狀況為觀測指標(biāo)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)材料：正常小鼠若干、注射器、胰島素溶液、葡萄糖溶液、生理鹽水等
請完善實(shí)驗(yàn)步驟：
①給每只生理狀況相似的正常小鼠

注射等量適量的胰島素溶液

注射等量適量的胰島素溶液

，觀察并記錄小鼠的活動狀況。
②等小鼠出現(xiàn)活動減少、甚至昏迷等

低血糖

低血糖

癥狀，將小鼠隨機(jī)均分為A、B兩組。
③A組小鼠

注射等量適量葡萄糖溶液

注射等量適量葡萄糖溶液

，B組小鼠

注射等量生理鹽水

注射等量生理鹽水

，一段時(shí)間后，觀察小鼠活動狀況。
結(jié)果及結(jié)論：A組小鼠癥狀得到緩解，B組小鼠狀況無變化，證明胰島素具降血糖功能。